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免疫组化一抗二抗选择“不二”乎！
发布时间：
2023-07-18
做过病理实验的人都知道，实验看似容易，但真想把它做好，还是需要花上很长一段时间去积累和摸索经验。本次中洪君(ID：boyuan6668)结合多年来做免疫组化的经验与大家分享如何选择一抗、二抗。
做过病理实验的人都知道，实验看似容易，但真想把它做好，还是需要花上很长一段时间去积累和摸索经验。本次中洪君(ID：boyuan6668)结合多年来做免疫组化的经验与大家分享如何选择一抗、二抗。
一抗的选择要点和技巧
1、单克隆和多克隆抗体的选择
由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低;而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色(可以通过封闭等避免)。
2、应用范围的选择
有的一抗只能用于 WB ( Western blotting)或免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀等;甚至表明石蜡切片或冰冻切片。
3、种属反应性的选择
这一点很重要，表明这种抗体可能存在种属差异，且这种抗体适合检测哪种种属动物体内的抗原。
4、种属来源
一般兔来源的多是多克隆;而小鼠来源的多是单克隆，但也有另外。根据此来源来选择相应的二抗。
二抗的原理及特点
1、SABC法
原理：SABC法是利用链酶亲和素(Streptavidin)与生物素(Biotin)特有的高度亲和力这一生物学性质，先将生物素与辣根过氧化物酶(HRP)结合，形成生物素化HRP，然后与链酶亲和素按一定比例混合，形成SABC复合物。用生物素化二抗与第一抗体结合，再与SABC复合物联结形成抗原～抗体～生物素化二抗～ SABC复合物。最后用底物显色剂显色。
特点：该法具有灵敏度高以及低背景染色等特点。
2、SP法
原理：根据生物素(Biotin) 与链霉亲和素(Streptavidin)具有强结合力的原理设计。在一抗(兔源与鼠源)与相应的靶抗原结合后，生物素化标记的抗多价二抗与一抗特异结合;二抗上标记的生物素与标记了辣根过氧化物酶(HRP)的链霉亲和素结合，形成抗原～特异性一抗～生物素化的二抗～HRP 标记的链霉亲和素复合物。
特点：该法孵育时间短(通常为10min)，灵敏度高以及低背景染色等特点。
3. Polymer酶标二抗法
原理：该法采用一段多聚氨基酸聚合物做为载体链，将该多聚物与二抗结合，然后可再标记上多个HRP/AP酶分子，所以同样具有很高的信号放大作用。
特点：灵敏度高;操作步骤简单;无需进行内源性的生物素封闭。
4. 直接酶标二抗法
该法是将HRP/AP酶分子直接标记于二抗上。因此需要普通的酶标二抗即可完成。实验简单，成本低，但是因为没有信号放大作用，所以对很多表达丰度不是很高的抗原就可能检测不到。
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