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肿瘤免疫治疗的新一代利器，CAR-NK细胞“征战”实体瘤和血液肿瘤
发布时间：
2023-07-18
提到“治愈性”抗癌免疫疗法-CAR-T，几乎无人不知。CAR-T疗法的大获成功让人类看到免疫疗法成功治愈癌症的巨大潜力，也成为人类攻克癌症历史上最值得镌刻的里程碑之一!全球首批接受CAR-T疗法的幸存者中有两位至今持续缓解时间超过十年!为癌症患者创下了长生存“神话”，
提到“治愈性”抗癌免疫疗法-CAR-T，几乎无人不知。CAR-T疗法的大获成功让人类看到免疫疗法成功治愈癌症的巨大潜力，也成为人类攻克癌症历史上最值得镌刻的里程碑之一!全球首批接受CAR-T疗法的幸存者中有两位至今持续缓解时间超过十年!为癌症患者创下了长生存“神话”，
目前全球已经上市了7款CAR-T疗法。但是，CAR T细胞疗法无法被忽视的局限性也一直困扰着科学家们，比如仅针对血液肿瘤有效，并且容易引发免疫风暴等。
因此，全球的研究人员都在快马加鞭的研发既能客服目前自体CAR-T疗法存在的重大挑战，又能产生更强杀伤效果的免疫疗法。经过不懈的努力，终于研发出新型的免疫治疗武器CAR-NK。
CAR结构的设计
NK细胞上表达的功能性CAR分子由三部分组成：胞外结构域、跨膜区以及胞内的信号结构域。胞外结构域由一个信号肽和识别抗原的单链抗体片段(scFv)组成，一段铰链区将这个结构连接到跨膜区，它也在细胞内连接到包含激活信号的胞内结构域。成功的CAR设计是通过仔细的设计和功能测试相结合来实现的。
载体骨架和启动子
载体骨架包含表达CAR所需的所有元件，如启动子、polyA信号和转录调控片段。
启动子的选择直接影响到转基因的表达水平。目前，对不同启动子在NK细胞系中的CAR表达和功能的比较只有一次报道，而对原代NK细胞没有比较数据。就这一次单个报告来看，还不能确定CAR-NK细胞的最佳启动子。
目前关于CAR-NK细胞的报道显示，多种启动子被用于驱动CAR的表达，无论是细胞系来源的还是原代NK细胞。在原代CAR-NK和CAR-NK细胞系中，病毒启动子(CMV、MPSV、MMLV、SFFV等)比组成性活性启动子(如EF1α、CMV和PGK)更常用。
信号肽
在信号肽中存在着巨大的异质性，这直接转化为不同水平的蛋白质分泌效率。对于CAR-NK和CAR-T细胞，还没有确定最佳信号肽的比较研究。目前，CD8a-SP是原代NK细胞最常用的信号肽序列(16%，71%的研究中未公布)和NK细胞系的免疫球蛋白重链或轻链信号肽(29%)。
单链抗体
单链抗体片段是CAR的肿瘤抗原结合域，该结构域将决定CAR-NK细胞的特异性和功能。
由于单链抗体不是抗体的天然形式，因此重链和轻链的顺序是人工确定的。到目前为止，对于CAR-NK设计，大多数更喜欢VH-VL方向，而不是VL-VH方向。Fujiwara等人证明重链和轻链的顺序不影响T细胞上抗KDR CAR的表达水平。
此外，细胞可以配备多个单链抗体，从而扩大CAR效应细胞的抗原识别能力。在这里，有多种选择：CARs可以用双元件的载体转导，诱导两个CAR结构的表达;或者将两个单链抗体融合在一个结构中，产生串联单链抗体的“单柄”CAR。虽然这些技术已用于生产CAR-T细胞，但CAR-NK细胞仍未知。
目前大多数临床CAR-T细胞试验都使用了来自小鼠抗体的单链抗体，这增加了抗小鼠IgG细胞宿主抗移植物病的风险，这个问题可以通过人源化或筛选全人抗体避免。然而不幸的是，由于这些CAR受体的嵌合特性，即使是人源化的单链抗体也可能诱导宿主抗独特型免疫反应。幸运的是，在迄今为止数量有限的CAR-NK临床试验中，没有发现与抗CAR免疫反应相关的重大副作用。
连接区
重链和轻链之间的连接区有助于稳定单链抗体的构象，过短会导致多聚体的形成，过长可能导致水解或降低VH和VL结构域之间的关联。对于CAR-NK细胞，五肽GGGGS的多聚体应用最为广泛，通常为3个重复。另一个旨在增强蛋白水解稳定性的连接体是Whitlow“218”连接体：GSTGSGSKPGSGEGSTKG。
目前，虽然大多数CAR-NK研究没有提供连接细节，但已有的研究报道中，有22项使用了G4S连接，有2项应用了218连接。
铰链区
铰链区是连接单链抗体单位和跨膜结构域的CAR细胞外结构区，它通常维持效应细胞中稳健的CAR表达和活性所需的稳定性。大多数CAR-NK构建使用CD8α或CD28胞外结构域的衍生物或基于IgG的铰链区。
铰链区的类型和长度对CAR的功能活动有重要影响。但是目前大多数信息全来自CAR-T领域，能否直接转化为CAR-NK还有待证明。
在CD28和CD8α铰链区之间的直接比较中，发现CD28更有可能促进CAR分子的二聚化，因此，CD28铰链区的CAR产生的激活刺激更强。虽然这可能是有益的，但也可能导致更严重的副作用。
IgG为基础的铰链区也广泛应用于CAR结构。基于IgG铰链区的一个主要优点是结构的灵活性，该结构通常由IgG1或IgG4的FC部分或Fc部分的CH2/CH3结构域组成。铰链区的长度可以调节以适应抗原识别，但研究发现，间隔区越短，细胞因子的产生越高，CAR-T细胞增殖越快，体内持久性和抗肿瘤效果越好。
对于CAR-NK细胞，大多数研究在原代NK细胞(16/35)和CAR-NK细胞系(41/72)中均采用CD8α铰链区。其它使用的铰链区包括CD28、IgG Fc结构域和DAP12。
跨膜结构域
跨膜(TM)结构域连接CAR的胞外结构域和细胞内激活信号结构域，CAR-NK最常用的TM部分来自CD3ζ、CD8和CD28，但其他如NKG2D、2B4、DNAM1也有被使用。
TM结构域的选择影响了CAR结构在细胞功能上的活化程度。通常在NK细胞上表达的分子如DNAM-1、2B4和NKG2D的TM会导致更多的CD107a脱颗粒和更高的细胞毒性，因此，TM的具体来源将决定CAR-NK的活性。
TM结构域的一个重要方面是，最佳TM区域应遵循T细胞或NK细胞上跨膜蛋白的蛋白质自然取向(N端到C端顺序)。NKG2D虽然是一种强大的NK细胞激活剂，然而，天然NKG2D具有C端到N端的跨膜区。
目前，CD8α和CD28修饰的TM在原代CAR-NK细胞中最常见，而CD28是CAR-NK细胞系的优选TM区域。
CAR-NK激活信号
CAR的细胞内激活信号的数量决定了其属于哪一“代”CAR。
第一代CAR-NK细胞与CAR-T细胞一样，只含有CD3ζ信号。第二代和第三代CAR-NK分别携带一个和两个额外的共刺激信号，共刺激分子通常来源于CD28家族(CD28和ICOS)、TNFR家族(4-1BB、OX40和CD27)或SLAM相关受体家族(2B4)。到目前为止，唯一公布的CAR-NK临床试验采用了第二代CAR-NK构建，该构建通过加入IL-15表达和诱导Caspase9增强活性。
目前大多数CAR结构依赖于CD3ζ链信号域，强烈的激活信号对于诱导有效的抗肿瘤反应很重要，但也可能导致效应细胞的快速衰竭。因此，共刺激域的组合可用于校准所需的免疫细胞反应。与基于4-1BB的 CARs相比，基于CD28的CARs表现出更快的效应器特征，诱导更高水平的IFN-γ、颗粒酶B、TNF-α。然而，这种强烈的共刺激信号也会导致活化诱导的细胞死亡(AICD)。
相比较，4-1BB-CD3ζ信号优先诱导记忆相关基因和持续的抗肿瘤活性。原因可能是4-1BB结构域改善了CD28结构域引起的T细胞耗竭。
在CAR-NK细胞系和原代CAR-NK细胞的研究中，CD3ζ几乎被普遍用作主要的激活域，其中大约一半携带一个额外的激活域，通常添加4-1BB或CD28。至于第三代结构，CD28/4-1BB/CD3ζ的组合是最常用的。
CAR-NK疗法“征战”实体瘤和血液肿瘤
目前CAR-NK疗法已在血液和实体瘤中遍地开花，取得了众多突破。
白血病、淋巴瘤-客观缓解率73%!CAR-NK疗法效果显著
根据MD安德森癌症中心I / IIa期试验的结果，以CD19为靶点的脐带血来源的新型CAR-NK细胞疗法，在大多数复发性/难治性非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的患者中显现出临床疗效，而且未观察到重大毒性反应。该试验结果发表在《新英格兰医学杂志》上。在参与该研究的11位患者中，有8位(73%)对治疗有反应，其中7位完全缓解，这意味着他们在中位随访13.8个月时无疾病迹象。
输注后1个月内对CD19 CAR NK细胞疗法的反应明显，并且在输注后1年内确认了这项治疗的持久性。
这是一种新型的疗法，首先需要从脐带血库中存储的脐带血中分离出NK细胞，并对它们进行基因工程改造，引入可识别癌细胞表面靶标的CAR。这些CAR NK细胞回输给患者。原文链接：赶超CAR-T!新型NK免疫细胞治疗在实体肿瘤中大放异彩!
卵巢癌-国内首个“即用型”CAR-NK疗法临床实验获批
2021年11月11日，国家药监局药品审评中心通过了一款我国自主研发的针对“晚期上皮性卵巢癌治疗的靶向间皮素(Mesothelin，MSLN)嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK)注射液”(简称：CAR-NK注射液)的临床试验申请。
据全球肿瘤医生网获悉，此款产品是国内首例“即用型”异体来源的CAR-NK产品。这也标志着我国的免疫细胞药物治疗实体瘤的研究迈入了新的里程碑!原文链接：抗癌2.0版：CAR-NK疗法崛起，有望成为治疗癌症的新希望
CAR-NK进军实体瘤，制服“癌王”有了新利器
作为美国癌症相关死亡的第三大原因，胰腺癌击败了大多数治疗方案，五年生存率仅为 10%。近期，研究人员宣布了一个好消息，细胞疗法能够显着抑制肿瘤，延长胰腺癌小鼠的寿命。
CYTO NK-203 是一种现成的同种异体 CAR NK 细胞疗法，源自脐带血，并具有提高 NK 细胞安全性和杀伤功效的一种潜在的疗法。
研究人员表示，在输注CAR-NK细胞后，胰腺癌小鼠持续了 90 多天，显着延长了胰腺癌小鼠的存活时间，表明这种方法有效。
这种技术与传统NK 细胞技术不同的是，需要对 NK 细胞进行工程改造，引入可识别癌细胞表面靶标的CAR，同时分泌 IL-15，维持 NK 细胞的存活，最后将这些能精准识别杀伤肿瘤细胞的CAR NK细胞回输给患者。
CytoImmune Therapeutics公司的首席执行官 Christina Coughlin 医学博士说：“我们很高兴能分享我们的 CAR NK 候选药物治疗胰腺癌的数据。这一基础数据支持 CYTO NK-203 的强大抗肿瘤活性，使我们相信CAR-NK疗法有可能为癌症患者提供更容易获得、安全和有效的基于细胞的治疗选择。”
另外的好消息是，经过几十年的临床研究，世界上已经实现了既增强了NK细胞活性，又成功增加了NK细胞的数量，完成了NK细胞回输体内对抗癌细胞必备的两项基本要求。目前，无论是中国、日本还是美国，NK细胞培养技术都已经非常成熟。
CAR-NK细胞治疗目前的难点
CAR-NK细胞在临床前研究中效果显著，且目前已经开展多项CAR-NK细胞治疗的临床试验，多集中于血液肿瘤研究并尝试CAR-T未能解决的实体肿瘤。
尽管CAR-NK细胞吸引了很多研究者的目光，其也存在一定问题：如NK细胞来源选择，尽管NK-92细胞系扩增简便，但其激活与增殖需要依赖IL-2，在临床应用中系统性的IL-2给药有很严重的副作用，并且会激活免疫抑制信号，另外CAR结构的取舍、转染方式的改善等，都需要进一步优化。通过对CAR-NK细胞如靶向抗原受体、iMC激活、IL-15等细胞因子、自杀分子和免疫检查点等方面进行改造，进一步提高其有效性和安全性。
自然杀伤细胞是一组独特的抗肿瘤效应细胞，具有不受MHC限制的细胞毒性、产生细胞因子和免疫记忆等功能，使其成为先天性和适应性免疫反应系统中的关键角色。CAR-NK细胞疗法是一个很有前途的临床研究领域，对某些癌症患者具有良好的安全性和初步疗效。与CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞具有自己独特的优点，但仍面临着一些挑战。这些挑战包括细胞增殖的改善，使细胞毒性的激活更有效，以及最终找到NK细胞的最佳重建方法。相信解决好这些问题，基于NK细胞优秀的抗肿瘤血统，极有可能在CAR修饰的武装下为肿瘤治疗带来新的突破。
文章来源： 全球肿瘤医生网，医脉通血液科，小药说药
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